انواع میکروسکوپ ها و کاربرد

میكروسكوپ یكی از وسایل آزمایشگاهی اصلی در آزمایشگاه گیاه شناسی است . كه در اینجا انواع آن را مورد بحث و بررسی قرار داده و طرز كار با میكروسكوپ نوری معمولی را به تفصیل ارائه مینمائیم .

میكروسكوپهای مختلف دارای بزرگنمائی های متفاوتی میباشند كه عموماً با وجود عدسیهای گوناگون، تصویر نمونه مورد نظر چند برابر میشود . اصول كلی در تمامی انواع میكروسكوپها براساس عبور نور با طول موجهای متفاوت از چندین عــدسی محدب میباشد كه هرچقدر طول موج نور بكار رفته در میكروسكوپ مزبور كوتاهتر باشد قدرت تفكیك و یا جــداكنندگی آن میكروسكوپ بیشتر است . برای مثال قدرت تفكیك چشم انسان 1/0 میلیمتر میباشد و میكروسكوپ نوری معمولی 24/0 میكرون . بیشتر میکروسکوپ هایی که تاکنون ابداع شده اند، میکروسکوپ نوری بودند. میکروسکوپ های نوری میکروسکوپ هایی هستند که برای بررسی یک جسم، از پرتوهای نور استفاده می کنند و نور را به جسم موردنظر می تابانند. با این همه میکروسکوپ نوری یک ضعف عمده دارد که محدودیت قدرت تفکیک آن است. به دلیل ماهیت موجی نور، موج های مختلف موجود در یک پرتو نور، با یکدیگر تداخل می کنند. به همین دلیل، وقتی با استفاده از عدسی یک پرتو نور را متمرکز می کنیم، بسته به طول موج نور و زاویه یی که عدسی می تواند نور را جمع کند، یک نقطه نورانی به پهنای 200 نانومتر در جهت های X و Y و عمق 500 نانومتر در راستای Z تشکیل می شود.در دهه 1930 انواع میکروسکوپ های الکترونی ابداع شد. هر چند این میکروسکوپ ها همچنان گران است، اما استفاده از آنها متداول شد. با ابداع میکروسکوپ های الکترونی (که از پرتوهای الکترون به جای پرتو نور استفاده می کند) قدرت تفکیک به شدت افزایش یافت، زیرا طول موج پرتوهای الکترون کمتر از طول موج فوتون است. فوتون ذره» تشکیل دهنده نور است.هر چند با ابداع میکروسکوپ های الکترونی دنیای کاملاً تازه یی از جزئیات به روی ما باز شد که پیش از آن مشاهده نکرده بودیم، اما استفاده از آن برای تصویربرداری از نمونه های زیستی چندان مناسب نیست. برای آنکه بتوانیم نمونه یی را با استفاده از میکروسکوپ الکترونی مشاهده کنیم، باید نمونه ها را در خلأ و به دور از هوا نگهداری کرد.

علاوه بر این پیش از اینکه بتوان جسم را زیر میکروسکوپ تماشا کرد، باید با استفاده از روش هایی آن را آماده کرد، از جمله برش جسم به لایه های نازک با استفاده از فهایی مثل اورانیوم، سرب یا پوشاندن نمونه با انواع فهای رسانا. در هر مورد ماده زیستی شناختی مشاهده شده به وسیله میکروسکوپ الکترونی دیگر زنده نیست.هر چند میکروسکوپ الکترونی در زیست شناسی و پزشکی کاربردهای فراوانی دارد، اما مطلوب آن است که بدون کشتن نمونه ها بتوانیم قدرت تفکیک را زیاد کنیم گرچه سلول های انسان ها و حیوانات به قدر کافی بزرگ است و می توان با استفاده از میکروسکوپ های نوری آنها را مشاهده کرد. کارکرد سلول به سنتز و انتقال پروتئین هایی بستگی دارد که با یکدیگر بر هم کنش دارند یا به هم متصل می شوند تا کار ویژه یی را انجام دهند. برای مثال واکنش های ایمنی شناختی بدن ما به توانایی سلول ها برای تولید پروتئین هایی بستگی دارد که می توانند با اجسام خارجی مقابله کنند. علاوه بر این مرگ سلول ها نیز به پروتئین ها مربوط می شود و ناتوانی سلول ها برای مرگ کنترل شده به سرطان منجر می شود. با توجه به اینکه قدرت تفکیک میکروسکوپ های نوری معمولی حدود 200 نانومتر است، نمی توان چگونگی برهم کنش پروتئین را دید و دریافت که آیا پروتئین ها اصولاً با یکدیگر برهم کنش دارند یا خیر، چگونه پروتئین ها به بخش های خاصی از سلول منتقل می شوند و چرا وجود آنها در این بخش خاص ضروری است. درک این مکانیسم ها در پژوهش های پزشکی و ابداع روش های درمانی جدید بسیار ضروری است.

تاریخچه

بعضی از وقایع مهم مربوط به میكروسكوپ به شرح زیرند:

در سال 1655 روبرت هوگ كه یك فیزیكدان بود، اولین مشاهده‌ی میكروسكوپی را انجام داد. وی برای اولین بار توانست بقایای دیواره‌ی سلولهای مرده‌ی گیاهی را در برشی از چوب‌پنبه مشاهده كند. در سال 1674 آنتونی‌وان لیوون هوك. كه یك پارچه فروش بود، برای اولین بار توانست تك سلولهای زنده (پروتوزوآ) را مشاهده كند. در سال 1683 آنتونی و آن لیوون هوگ با تكمیل میكروسكوپی كه ساخته بود، توانست باكتریها را نیز مشاهده كند. در سال 1932 اولین میكروسكوپ الكترونی اختراع شد.

تاریخچه میكروسكوپ

در روزگاران قدیم, كوچكترین موجودات زنده ای كه مردم می شناختند آنهایی بودند كه به زحمت با چشم دیده می شوند. ولی آیا ممكن بود موجوداتی هم باشند كه با چشم دیده نشوند؟ اگر با چشم دیده نمی شدند، با چه وسیله ای ممكن بود آنها را دید. البته در آن زمانم مردم به وسایلی می توانستند كاری كنند كه چیزهای خیلی كوچك بزرگتر از آنچه بودند نشان داده شوند. مثلاً بعضی ازمردم متوجه شده بودند كه اگر از میان شیشه ای كه سطح آن منحنی باشد به چیزهای خیلی كوچك نگاه كنند, آنها بزرگتر از آنچه هستند به نظر می آیند.

با این همه, فقط در حدود سال 1650 میلادی بود كه دانشمندان با این شیشه های منحنی به چیزهای خیلی كوچك نگاه كردند و به دقت به بررسی آنها پرداختند . اسم این شیشه ها را, كه سطح منحنی داشتند, عدسی گذاشتند, زیر اشكال آنها مثل شكل دانه های عدس بود. معمولاً برای اینكه به چیزهای بسیار كوچك نگاه كنند, بیش از یك عدسی به كار می بردند. عدسی ها را در دو انتهای یك لوله فی جا می دادند.

آنهارا طوری بر جا می دادند كه چیزهای بسیار كوچك بهتر دیده شوند. اسم این لوله را, با عدسی هایی كه درون آن بود, میكروسكوپ گذاشتند.

 میكروسكوپ از دو واژه یونانی میكرو, به معنی كوچك و سكوپ, به معنی دیدن, گرفته شده است. بنابراین میكروسكوپ یعنی دیدن چیزهای كوچك. یكی از موجودات كوچك زنده كه دانشمندان بیش از همه آن را مورد مطالعه قرار دادند كك بود. برای همین بود كه اسم اولین میكروسكوپ ها را شیشه های کكی گذاشته بودند.

قبل از اختراع میكروسكوپ در اواسط قرن هفدهم, مشاهده سلول مقدور نبود, زیرا سلول واحد بسیار كوچكی است كه با چشم غیر مسلح قابل رویت نیست. روبرت هوك اول بار در سال 1665 زیر میكروسكوپ ابتدایی كه خود ساخته بود سلولهای مرده را در  برش های چوب پنبه و نوعی كمك مشاهده كرد. این سلولهای تو خالی و متصل به هم, شكل اتاقكهای لانه زنبور را داشتند و هوك آنها را سلولی نامید كه به زبان لاتین مفهوم اتاقكهای كوچك را دارد.

 چند سال بعد طبیعت شناسی بنام آنتونی وان لیوون هوك سلولهای زنده را در قطره های آبی كه از بركه برداشته بود در زیر میكروسكوپ مشاهده كرد و آنها را جانوران كوچك نامید.

او چند نمونه خشك شده خود را بین سالهای 1674 و 1687 به فرهنگستان سلطنتی لندن فرستاد.

لیوون هوك بر روی هم توانست 419 میكروسكوپ و عدسی بسازد. او هر بار كه عدسی یا میكروسكوپ بهتری می ساخت, می توانست میكرو ارگانیسمهای كوچكتری ببینید.

در سال 1683 میلادی, عدسی دیگری ساخت كه می توانست چیزهای خیلی كوچك را نشان دهد. لیوون هوك فكر می كرد كه این چیزهای خیلی كوچك باید موجودات زنده ای باشند. ولی این چیزها به قدری كوچك بودند كه فقط مثل نقطه ها و میله های كوچكی به نظر می آمدند. او نمی توانست عدسی دیگری بسازد كه آن قدر قوی باشد كه بتواند آنها را واضح نشان دهد. این بود كه ناچار مطالعه آنها را رها كرد.

بعدها این چیزهای كوچك را كه او نخستین بار دید باكتری نامیدند. باكتری از واژه ای یونانی به معنی میله كوچك گرفته شده است. لیوون هوك نخستین كسی بود كه میكروبها را دید, و تا صد سال بعد هیچ كس دیگری پیدا نشد كه بتواند كاری بهتر از او انجام دهد. سر انجام, در سالهای دهه 1780 میلادی, اوتوفریدریك مولر, زیست شناس دانماركی ترتیبی داد كه میكروبها اندكی واضعتر نشان داده شوند. او نخستین كسی بود كه كوشید تا باكتریها را برحسب شلهای متفاوت آنها به گروههای مختلف تقسیم كند.

عدسیها برای اینكه چیزها را بزرگتر از آنچه هستند نشان دهند پرتوهای نور را می شكنند, ولی همه رنگ های نور را به یك اندازه نمی شكنند. نور معمولی تركیبی است از چندین رنگ. در آن زمان, وقتیكه میكروسكوپها را طوری میزان می كردند كه چیزهای كوچك را به یكی از این چند رنگ بطور واضح نشان دهند, رنگهای دیگر مبهم می شدند. برای همین باكتریهایی كه زیر میكروسكوپ دیده می شدند مبهم به نظر می آمدند و مثل این بود كه كرك رنگینی دورشان را گرفته باشد. ولی در سال 30 میلادی, جوزف جكسون لیستر, عینكساز انگلیسی كه سر و كارش با ساختن عدسی بود, دو نوع عدسی را با هم تركیب كرد. هر یك از آنها رنگها را به نحو متفاوتی می شكست. هر تاثیری كه یك عدسی در رنگها داشت, عكس آن تاثیر را عدسی دیگر در آنها داشت, چنانكه یك عدسی تاثیرهای نامساعد عدسی دیگر را خنثی می كرد. به این ترتیب, تركیب این دو نوع عدسی با یكدیگر سبب می شد كه چیزهای كوچك به رنگ اصلی خود و بطور واضح نشان داده شوند. با بهبود روشهای میكروسكوپی, دانشمندان توانستند بافتهای گوناگون را بررسی كنند.

اختراع میكروسكوپ تحول بزرگی در علم زیست شناسی بوجود آورد. با به كارگیری این ابزار قوی, بشر توانست ذراتی را كه با چشم دیده نمی شوند مشاهده كند: یك سلول جانوری را در نظر بگیرید كه قطر متوسط آن بین ۱۰تا۲۰ است این سلول ۵۰بار کوچکتر ازریزترین جسم قابل روئیت با چشم غیر مسلح است بنابراین تنها با اختراع میکروسوپ نوری بود که آدمی توانست سلول را ببیند.

بعد از گذشت چند قرن, میكروسكوپ همچنان نقش مهمی در پژوهش های زیستی ایفا می كند و در سالهای اخیر تحولات شگرفی در بهبود كیفیت آن صورت گرفته است. یكی از عمده ترین پیشرفتها در ساخت میكروسكوپ, اختراع نوع الكترونی آن در دهه 1940 بود كه امكان مشاهده ذرات و اندامكهای درون سلولی را بهتر از گذشته فراهم كرد. در ضمن باید تاكید شود كه امروزه میكروسكوپ نه تنها جهت بررسی شكل و ساختار نمونه های زیستی مورد استفاده قرار می گیرد, بلكه برای تعیین ارتباط بین ساختارهای تشكیل دهنده سلول و فعالیتهای گوناگون آنها نیز نقش به سزایی ایفا می كند. انواع میكروسكوپها شامل موارد زیر می باشد:

1- میكروسكوپ زمینه روشن  2- میكروسكوپ فلور سنت 3- میكروسكوپ اختلاف فاز 4- میكروسكوپ تداخلی  5- میكروسكوپ زمینه سیاه 6- میكروسكوپ الكترونی گذاره 7- میكروسكوپ الكترونی نگاره 8- میكروسكوپ STM

تقسیم بندی انواع میكروسكوپ

1-  میكروسكوپ نوری ( Light Microscope   )

منبع نور در این میكروسكوپ نور مرئی میباشد و با عبور از چندین عدسی محدب كه در آن تعبیه شده است و نیز یك منشور كه مسیر نور را تغییر میدهد ( قدرت تفكیك 24/0 میكرون ) .

میكروسكوپهای نوری

میكروسكوپ نوری زمینه روشن: قسمتهای مهم یك میكروسكوپ نوری عبارتند از:

1- عدسی چشمی: این عدسی برای مطالعه و مشاهده تصویر است.

2- عدسی شیئی: این عدسی برای بزرگنمایی است و شامل چهار عدسی می باشد:

الف) عدسی شماره 4 (عدسی كوچك)

ب) عدسی شماره 10 (عدسی خشك)

ج) عدسی شماره 40 (عدسی خشك)

د) عدسی شماره 100 (عدسی روغنی)

3- كندانسور: كندانسور نور را جمع كرده و آن را بطور مستقیم روی نمونه هدایت می كند.

4- دیافراگم: مقدار نور ورودی را كم و زیاد می كند.

5- ماكرومتر:ماكرومتر صفحه میكروسكوپ را بالا و پایین برده و برای پیدا كردن تصویر نمونه بكار می رود.

6- میكرومتر: تصویر تنظیم شده را واضحتر كرده و آن را برای مشاده مشخص تر می كند.

بین عدسی شیئی (عدسی 100) و نمونه فاصله ای در حدودmm 1/8  وجود دارد كه این فاصله را فاصله كانونی گویند كه با روغن امرسیون این فاصله را پر می كنند در غیر این صورت بعلت وجود هوا و شكست نور عبوری از نمونه, تصویر ناواضح خواهد بود.

نمونه روی لام (تیغ شیشه ای) گذاشته می شود و سپس روی جایگاه نمونه میكروسكوپ قرار می گیرد. نور از چراغی در پایین میكروسكوپ توسط كندانسور بر سطح نمونه متمركز می شود. نوری كه توسط نمونه جذب نشده و از آن عبور كرده است به عدسی شیئی می رسد و در نتیجه تصویری بزرگ شده از نمونه بدست می آید. این تصویر بار دیگر توسط عدسی چشمی بزرگ می شود. بزرگنمایی نهایی, حاصل ضرب بزرگنمایی های دو عدسی است. چنانچه بزرگنمایی عدسی شیئی 100 و بزرگنمایی عدسی چشمی 10 باشد, بزرگنمایی نهایی 1000 برابر خواهد بود.

مهمترین ویژگی عدسی میكروسكوپ قدرت جداسازی یعنی توانایی تشخیص بین دو نقطه نزدیك به هم است. قدرت جداسازی یك میكروسكوپ در عمل نمایانگر كوچكترین جسم قابل رویت با آن میكروسكوپ است و هر چه بیشتر باشد, اجسام كوچكتری را با آن میكروسكوپ می توان دید. قدرت جداسازی هر میكروسكوپ معمولاَ با حد تفكیك یا R مشخص می شود. حد تفكیك مساوی است با نزدیكترین فاصله بین دو جسم بطوریكه هر یك هنوز بصورت مجزا قابل مشاهده باشد. هر قدر میزان R كوچكتر باشد, قدرت جداسازی میكروسكوپ بیشتر و بهتر است. عوامل بسیاری در تعیین R دخالت دارند, از جمله طول موج تابش كه با R رابطه مستقیم دارد. از لحاظ نظری, كوچكترین مقدار ممكن برای R در میكروسكوپ نور حدود 200nm است كه تنها بهترین میكروسكوپهای نوری این حد تفكیك را دارند. حد تفكیك در اغلب میكروسكوپ های نوری كمتر از 500nm نیست, لذا اشیایی كوچكتر از 500nm با آنها قابل مشاهده نیستند. مشاهده سلولهای باكتری و میتوكندری با میكروسكوپ نوری مقدور است, اما مشاهده ریبوزوم ها با آن ممكن نیست. تفكیك انواع سلولها, مثلاَ گلبول های قرمز از گلبولهای سفید خون یا سلولهای فیبرو بلاستی از سلولهای پوششی با میكروسكوپ نوری امكان پذیر است. این میكروسكوپ در آزمایشات باكتری شناسی, انگل شناسی, قارچ شناسی, ه شناسی و بافت شناسی كاربرد دارد.

اجزای میكروسكوپ نوری

       1- اجزای نوری : اجزای نوری عمدتاً مشتمل بر منبع تغذیه نور و قطعات مرتبط با آن میباشد ، از قبیل لامپ با ولتاژ 20 وات ، فیلتر تصحیح نور و كندانسور كه كندانسور مشمل بر پنج قطعه است كه نور را تصحیح كرده و بر روی نمونه یا شیء مورد بررسی متمركز میكند:

1 – فیلتر رنگی ( تصحیح نور )                     2 – دیافراگم كه حجم نور را تنظیم میكند

3 – دو عدد عدسی محدب        4 – پیچ نگهدارنده كندانسور       5 - پیچ تنظیم دیافراگم

       2 – اجزای مكانیكی :

1 – پایه ( Base ) : كلیه قطعات میكروسكوپ بر روی پایه مستقر میباشد . در برخی از مدلهای میكروسكوپ نوری منبع نور ، فیوز و كابل برق در پایه تعبیه میگردد .

2 – دسته ( Handle ) : جهت حمل و نقل میكروسكوپ از دسته استفاده میشود . نكته قابل توجه آنكه به هنگام جابجایی میكروسكوپ آن را روی میز كار نمی كشیم .

3 – لوله میكروسكوپ  ( Barrel ): مشتمل بر عدسی شیئی ( Ocular lens ) و عدسی چشمی (Objective lens) كه با بزرگنــمائی های مختلف طراحی می شوند. عــدسی شیـئی دارای بزرگنمائی های X4 ، X10 ،X40 ، X60 و X100 و عدسی چشمی دارای بزرگنمائی های X10 ، X15 ، X میباشد كه بسته به نوع میكروسكوپ متفاوت است. عدسی شیئی معمولاً از چندین عدسی محدب كه در آن تعبیه شده است تشكیل میگردد.

4 -  صفحه گردان یا متحرك ( Revolver ) : عدسیهای شیئی بر روی این صفحه قرار میگیرند و با چرخاندن آن موقعیت عدسیهای شیئی تغییر میكند.

5 -  پیچ حركات تند ( Macrometrique ) : این پیچ بر روی دسته تعبیه شده است و باعث میگردد كه صفحه پلاتین با سرعت بیشتری در جهت عمودی جابجا شود.

6 – پیچ حركات كند ( Micrometrique ) : این پیچ بر روی پیچ حركات تند قرار داد و صفحه پلاتین را در جهت عمودی و درحد میكرون جابجا میكند .

7 – صفحه پلاتین ( Platine plate )  : صفحه ای است كه نمونه مورد نظر روی آن قرار میگیرد و در جهت طول و عرض دارای دو خط كش مدرج میباشد كه جهت ثبت و یادداشت مكان یك نمونه خاص بكار میرود .

8 – پیچ طول و عرض : این پیچ زیر صفحه پلاتین قرار دارد كه آن را در جهت طول و عرض جابجا میكند .

بزرگنمائی یك میكروسكوپ حاصل ضرب بزرگنمائی عدسی شیئی در بزرگنمائی عدسی چشمی میباشد .

2 – میكروسكوپ ماوراء بنفش ( Ultra Violet Microscope )

میكروسكوپ ماوراء بنفش یا میكروسكوپ U.V.  كه منبع تغذیه نور ، اشعه U.V. میباشد. نسبت به میكروسكوپ نوری معمولی قدرت تفكیك بالاتری داشته چراكه اشعه ماوراء بنفش طول موج كوتاهتری نسبت به نور مرئی دارد . عدسی شیئی بكار رفته در این میكروسكوپ از جنس كوارتز میباشد. بدلیل مضر بودن اشعه ماوراء بنفش برای چشم انسان، از تصویر شیء عكسبرداری شده و سپس بر روی صفحه مانیتور قابل مشاهده است ( قدرت تفكیك 600 آنگستروم ).

 3 – میكروسكوپ فلورسانس (Fluorescence Microscope )

میکروسکوپ فلورسانت (fluorescent microscope)

انواع خاصی از میکروسکوپ نوری که منبع نور آن پرتوهای فرابنفش است.برای مشاهده نمونه زیر این میکروسکوپ ها بخش ها یا ملکول های ویژه داخل سلول با مواد فلورسانت یا نورافشان رنگ آمیزی می شوند. زمانی هدف تشخیص پروتئین های خاص یا جایگاه آنها در سلول باشد، روش های معمولی رنگ آمیزی که پروتئین ها را به طور عام رنگ می کنند قابل استفاده نیست.برای رنگ آمیزی اختصاصی، معمولا از پادتن های اختصاصی متصل به مواد فلورسانت استفاده می شود.مواد فلورسانت نور را در طول موج فرابنفش جذب می کنند و در طول موج بلندتری در طیف مرئی تابش می کنند. تصویری که دیده می شود حاصل نور تابش شده از نمونه است. رودامین و فلورسئین دو نوع از رنگ های معمول فلورسانت هستند که به ترتیب نور قرمز و سبز از خود تابش می کنند.

کارکرد میکروسکوپ های فلورسانس

کارکرد میکروسکوپ های فلورسانس

در ابتدای قرن بیستم پدیده فلورسانس در ساخت میکروسکوپ به کار گرفته شد. فلورسانس یکی از پدیده های مربوط به نورتابی(لومین سانس) است. ما معمولاً وقتی جسمی را می بینیم که نور از آن جسم بازتاب می شود. رنگ جسم نیز به این موضوع وابسته است که جسم چه طول موجی را بازتاب می کند. در پدیده فلورسانس مولکول یک فوتون(یک ذره نور) با طول موج خاص را جذب و سپس آن را با طول موج بلندتری منتشر می کند.فلورسانس یکی از روش های بسیار متداول در تصویربرداری بافت های زیست شناختی است. مواد زیست شناختی معمولاً نور را به شدت متفرق می کنند و در نتیجه تماشای آن ورای سطح سلول دشوار است. در پدیده فلورسانس معمولاً طول موج نور گسیل شده از طول موج نور تابیده شده بیشتر است، بنابراین نور متفرق شده از سطح سلول را می توان از نور تابیده شده به سلول تفکیک کرد. برای انجام این کار از آینه های دورنگی استفاده می کنند. این آینه ها نور تابیده شده را دوباره به نمونه برمی گردانند، اما نور فلورسانس از آن عبور می کند، در نتیجه تماشای ساختارهای درونی سلول امکان پذیر می شود.برخی مواد زیست شناختی به طور طبیعی فلورسنت هستند، اما رنگ ها و پروتئین های فلورسنت فراوانی نیز وجود دارد که می توان از آنها برای رنگ آمیزی بخش های ویژه یک سلول مثل هسته استفاده کرد. حتی می توان آنها را به پروتئین های خاص درون سلول متصل کرد، در نتیجه پیگیری حرکت آنها درون سلول امکان پذیر می شود.استفاده از رنگ ها و پروتئین های نور کلید زدنی فلورسنت که به تازگی کشف شده است، کاربردهای بسیاری در تصویربرداری فلورسانس دارد. این مولکول ها می توانند دو حالت داشته باشند؛ یک حالت درخشان یا حالت فلورسنت و یک حالت تاریک یا غیرفلورسنت.کلیدزنی بین این دو حالت با تاباندن نور با دو طول موج متفاوت انجام می شود.

یکی از کاربردهای مولکول های نور کلینی ردیابی پروتئین ها است. اگر مولکول های فلورسنت به پروتئین های خاص متصل شوند و یک بخش کوچک از آنها فعال شود، پیگیری جابه جایی پروتئین ها بسیار آسان تر از حالتی است که همه پروتئین های درون سلول نور را گسیل کنند. علاوه بر این لحظه دقیق فعال سازی را می توان کنترل کرد.

قدرت تفکیک زیاد بدون کشتن نمونه

چگونه می توان بدون آنکه نمونه های زیست شناختی را از بین برد، میکروسکوپ هایی با قدرت تفکیک زیاد ساخت؟ از آنجایی که قدرت تفکیک یک میکروسکوپ به طول موج بستگی دارد، یک راه برای افزایش قدرت تفکیک کاهش دادن طول موج است.

برای مشاهده نمونه بوسیله این میكروسكوپ ها, بخش ها یا مولكول های ویژه در داخل سلول با مواد فلورسنت یا نور افشان رنگ آمیزی می شوند. زمانی كه هدف تشخیص پروتئین های خاص یا جایگاه آنها در سلول باشد, روش های معمول رنگ آمیزی كه پروتئین ها را به طور عام رنگ می كنند قابل استفاده نیستند. برای رنگ آمیزی اختصاصی, معمولاَ از پادتن های اختصاصی متصل به مواد فلورسنت استفاده می شود.

در میكروسكوپ فلورسنت از ماوراء بنفش بعنوان نور استفاده می شود. ماوراء بنفش طول موج كمتر، انرژی بیشتر و قدرت نفوذ زیادی دارد. عدسی هایی كه در میكروسكوپ فلورسنت به كار رفته اند از جنس كوارتز می باشد چون نور ماوراء بنفش از عدسی های معمولی عبور نمی كند.

این نوع میكروسكوپ به دو دسته فیلتر مجهز هستند. دسته اول بین منبع نور و نمونه قرار دارد و فقط اجازه می دهد كه امواج تابش شده از ماده فلورسنت، عبور نمایند. دسته دوم بین نمونه و عدسی چشمی قرار دارد و تنها به امواج تابش شده از ماده فلورسنت، اجازه عبور می دهد. رود امین و فلورسئین دو نوع از رنگهای معمولی فلورسنت هستند كه به ترتیب نور قرمز و سبز از خود تابش می كنند. این میكروسكوپ برای مطالعه انواع آنتی بادی از نظر ایمنی شناسی و بررسی بعضی از باكتریها مثل مایكو باكتریوم توبركلوزیس ( میكروب سل) از نظر باكتری شناسی كار برد دارد.

بطوركلی مواد از لحاظ خاصیت فلورسانس دو نوعند :

- فلورسانس اولیه كه این مواد ذاتاٌ خاصیت فلورسانس دارند یعنی از خود نور ساطع میكنند مثل ویتامینها و رنگها .

- فلورسانس ثانویه كه از خود خاصیت فلورسانسی نداشته و با رنگ آمیزی و معرفهای گوناگون از قبیل سولفات بربرین و نارنجی آكریدین خاصیت فلورسانسی را به آنها القاء میكنیم. 

منبع تغذیه نور در این میكروسكوپ اشعه U.V. میباشد. در اینجا نیز از تصویر شیء عكسبرداری شده كه بر روی صفحه مانیتور قابل مشاهده است

 4 –  میكروسكوپ زمینه سیاه ( Dark Field Microscope )

مطالعه سلول های زنده با این میكروسكوپ ها نیز مقدور است. سیستم های نوری خاصی در تمام این نوع میكروسكوپ ها وجود دارد كه تباین كافی بین اجزار سلول ایجاد كرده، مشاهده سلول های زنده را مقدور می سازند.

در میكروسكوپ زمینه سیاه نور حامله از منبع نوری به شكل مخروط در می آید و انوار از اطراف به نمونه تابیده می شود این كار توسط كندانسور خاص این میكروسكوپ انجام می گیرد. در نتیجه تصویر نمونه بصورت روشن در یك زمینه تاریك مشاهده می شود. استفاده از میكروسكوپ زمینه سیاه برای مشاهده حركت باكتری معمول است ( مثل اسپیروكت تروپونها پالیدوم ( عامل بیماری سیفیلیس).

منبع تغذیه نور در این نوع میكروسكوپ نور مرئی میباشد و با ایجاد انكسار نور توسط آئینه های محدب و مقعر شیء یا نمونه مورد بررسی، شفاف و نورانی در زمینه سیاه دیده میشود.

5 -  میكروسكوپ اختلاف فاز ( Phase Contrast Microscope )

مزیت میکروسکوپ اختلاف فاز در این است که می توانیم با آن سلول های زنده را با جزئیات بیشتر مشاهده کنیم.تیمارهایی مثل تثبیت نمونه می توانند دگرگونی هایی در ساختار درونی سلول بوجود آورند. بنابراین مطالعه سلول های زنده که هیچ تیماری ندیده اند خیلی مطلوب است. می توان فرایند هایی مثل تقسیم میتوز(mitosis) در سلول های زنده را نیز با این میکروسکوپ ها مطالعه کرد. در برخی موارد برای عکس برداری پیوسته و دراز مدت از سلول فعال ، دوربینی به میکروسکوپ وصل می شود.مطالعه سلول های زنده با میکروسکوپ تداخلی(interference microscope) و میکروسکوپ زمینه سیاه(dark field microscope) نیز مقدور است. سیسم های نوری خاصی در تمام این نوع میکروسکوپ ها وجود دارد که به علت ویژگی آنها تباین کافی بین اجزای سلول ایجاد و مشاهده ی سلول های زنده مقدور می شود. استفاده از میکروسکوپ زمینه سیاه برای مشاهده ی حرکت باکتری معمول است، که در این مورد ایجاد تباین بین سلول باکتری زنده و محیط اطرافش مهم است.

مزیّت میكروسكوپ اختلاف فاز در این است كه می توانیم با آن سلولهای زنده را با جزئیات بیشتر مشاهده كنیم. تیمهایی مثل تثبیت نمونه می توانند دگرگونی هایی در ساختار درونی سلول، بوجود آورند. بنابراین مطالعه سلول های زنده ای كه هیچ گونه تیماری ندیده اند خیلی مطلوب است. می توان فرآیندهایی مثل تقسیم میتوز در سلول های زنده را نیز با این نوع میكروسكوپ ها مطالعه كرد. در برخی موارد، برای عكس برداری پیوسته و دراز مدت از سلول فعال، دوربین به میكروسكوپ وصل می شود.

در میكروسكوپ اختلاف فاز نور حاصله از منبع نوری به انوار مختلف شكسته شده و شكسته نشده تقسیم می شود این كار توس دیافراگم مخصوص این میكروسكوپ انجام می گیرد. انواری كه می شكنند. به جسم یا نمونه نفوذ نمی كنند اما انواری كه نمی شكنند به جسم یا نمونه نفوذ می كنند در نتیجه بین نمونه و محیط اطراف آن اختلاف بوجود می آید و نمونه به صورت شفاف دیده می شود.

منبع تغذیه نور در این نوع میكروسكوپ نور مرئی میباشد و برای بررسی بافتها یا نمونه هایی كه اختلاف انكساری نوری كمی دارند مورد استفاده قرار میگیرد بدین منظور صفحه سوراخ داری به نام پلاك فاز در كندانسور تعبیه میشود .

روش استفاده از میکروسکوپ فاز – کنتراست

نحوه کار با میکروسکوپ فاز – کنتراست در انواع مختلف آن متفاوت است و لذا بایستی بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده عمل نمود و لیکن در اکثر آنها نحوه کار با آن به شرح زیر می‌باشد:

·         لامپ را روشن نموده و سپس به تدریج شدت آنرا تا نصف یا 4/3 شدت ماکزیمم افزایش دهید. روزنه لامپ و کندانسور substage را کاملا باز نمائید. امتحان نمائید که فیلتر نوری در محل خود بطور مناسب واقع است. حلقه‌هایی که در زیر کندانسور واقع است را کنار بزنید.

·         در ابتدا با استفاده از عدسی شیئی با توان بالا (mm 4 عدسی شیئی خشک) شروع نمائید. فو سیستم را تنظیم نموده به گونه‌ای که شیئی و stage را بخوبی بتوان تفکیک نمود. پس از آن عدسی شیئی را به موقعیت مربوطه‌اش منتقل نمائید.

·         کندانسور زیر stage را بگونه‌ای تنظیم نمائید که حدود 5 میلیمتر زیر stage واقع شود.

·         اسلاید را که حاوی نمونه است و همچنین لامپ آن را بر روی stage قرار دهید به گونه‌ای که فیلم به سمت بالا واقع شود. با فشار کمی بر روی اسلاید اتصال یکنواختی با stage فراهم آورید.

·         تصویر را فو نموده و همچنین توجه شود که در وجود حباب بتوان آنرا مشاهده و سپس حذف نمود. جهت فو نمودن اگر خطی بر روی اسلاید قرار دارد و یا آنکه در صورت نبودن می‌توان از خود نمونه برای فو نمودن استفاده نمود. عمل فو کردن با یستی بدقت انجام شود.

·         یکی از عدسیهای چشمی را برداشته و بجایش تلسکوپ مربوطه را بگذارید. با حرکت دادن آن ، آنرا برای صفحه فاز در بالای عدسی شیئی فو نمائید. فو میکروسکوپ را تغییر نداده و توسط چشمی کنترل کندی که فو آن تغییر نکرده است.

·         صفحه دیافراگم مناسب عدسی شیئی مورد استفاده را در محل خود بین کندانسور و لامپ قرار دهید. سپس کندانسور را فو نمائید بگونه‌ای که تصویر حلقه روشن از داخل تلسکوپ برابر با حلقه روی صفحه فاز باشد. مجددا از طریق چشم دیگر که هنوز در محل خودش قرار دارد ببنید که هنوز تصویر فو می‌باشد.

·         با کنار زدن دیافراگم مجددا به داخل تلسکوپ نگاه نموده و با تغییر پیچهای مربوط به کندانسور آنرا بگونه‌ای تنظیم نمائید که تصویر فیلمان بطور واضح روی حلقه مربوط به صفحه فاز قرار گیرد.

·         دیافراگم را مجددا به محل خود برگردانید در حالی که بداخل تلسکوپ نگاه می‌کنید و سپس دیافراگم را به مرکز بوسیله پیچهای مربوطه منتقل نمائید. حلقه روشن بایستی دقیقا در بین حلقه‌های صفحه فاز قرار گیرند. لبه‌های این دو بایستی بر روی همدیگر بیفتد و در ضمن بایستی برنگ سفید باشد و نه رنگ دیگر. اندازه حلقه نوری را می‌توان با تنظیم فو کندانسور تنظیم نمود.

·         مجددا از طریق عدسی چشمی که هنوز در محل خود قرار دارد به نمونه نگاه کرده و امتحان کنید که هنوز سیستم فو می‌باشد. در صورت وم بایستی فو را تنظیم نمود. در این حالت با نگاه به داخل تلسکوپ مجدددا حلقه نور را تنظیم نمائید.

·         تلسکوپ را خارج نموده و مجدددا عدسی چشمی دوم را سر جایش بگذارید. نمونه را مورد مطالعه قرار داده ضمن آنکه در صورت نیاز بایستی نور را نیز تنظیم نمائیم با حرکت دادن نمونه می‌توان ضخامتها و نواحی مختلف نمونه را بررسی و مطالعه نمود. هر از چند گاهی با جایگزین تلسکوپ وضعیت حلقه روشن را امتحان نمائید.

·         آزمایش با عدسی mm 2 امیرسیون روغنی: فو سیستم را چرخانده به گونه‌ای که بوضوح بتوان اسلاید و عدسی شیئی را مشاهده نمود. دیافراگم را برداشته و سپس یک قطره روغن روی لامل قرار دهید. عدسی mm 2 ایمرسیون روغنی را به محل خود منتقل نموده و سپس فو را حرکت داده به گونه‌ای که بین عدسی شیئی و روغن تماس برقرار شود. مراحل 14 تا 11 را با استفاده از دیافراگم مناسب عدسی مورد استفاده تکرار نمائید.

6 -  میكروسكوپ الكترونی ( Electron Microscope )

قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی از میکروسکوپ نوری بهتر است به این معنی که با میکروسکوپ الکترونی اجزای کوچکتری را می توان دید. قبلا گفته شد حد تفکیک (R) به طول موج نوری بستگی دارد که به نمونه می تابد. در حقیقت بین این دو رابطه مستقیمی وجود دارد یعنی هر چقدر طول موج تابشی کوچکتر باشد ،R نیز کوچکتر و قدرت جداسازی بیشتر است. در میکروسکوپ الکترونی بجای استفاده از نور مرئی از امواج الکترون ها استفاده می شود. در شرایط مناسب طول موج الکترون ها به nm ۰/۰۰۵ می رسد. در این طول موج بهترین R ممکن حدود nm ۰/۰۰۲ است. در عمل به علت محدودیت های دیگر ، قدرت جداسازی میکروسکوپ های الکترونی هیچ وقت به این خوبی نیست.حد تفکیک با میکروسکوپ الکترونی برای ملکول های تخلیص شده ی زیستی ، حدود ۰/۱ نانومتر و برای سلول ها ۲ نانومتر است که دست کم 100 برابر بهتر از بهترین میکروسکوپ های نوری است.

دو نوع میکروسکوپ الکترونی به نام میکروسکوپ الکترونی گذاره و میکروسکوپ الکترونی نگاره وجود دارد. میکروسکوپ الکترونی گذاره (transmission electron microscope) زودتر اختراع شد و قدرت جداسازی بهتری دارد. در این نوع میکروسکوپ ، الکترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می کنند و از مناطقی دیگر بازتابیده می شوند. عامل تعیین کننده در این امر در نهایت ویژگی اتم های تشکیل دهنده ی مناطق مختلف سلول است. الکترون های عبوری در دستگاه تشخیص داده می شوند و تصویری از نمونه حاصل می شود. سلول های زنده با میکروسکوپ الکترونی قابل مشاهده نیست.

یكی از تجهیزات بزرگ علمی میكروسكوپ الكترونی است كه براساس قوانین نوری كار میكند دراین دستگاه شار الكترون پر انرژی از یك منبع الكترون خارج شده وتحت شتاب به طرف هدف میرود در مسیر خود از روزنه های تعبیه شده در یك ف عبور كرده وبا عبور از لنزهای مغناطیسی بر روی شی مورد نظر تابانده شده ودر نتیجه بازتاب نور تصویر شی دیده خواهد شد.

اطلاعاتی را كه میكروسكوپ الكترونی ارائه میدهد:

1 - توپوگرافی شئ : (نقشه برداری )كه با اشكار كردن مشخصات سطح و بافت داخلی شئ میتوان به خواصی مانند سفتی و میزان ار تجائی بودن ان پی برد.

2 - مورفولوژی (ریخت شناسی): از ان رو كه در این رویت شكل و سایز ذرات مشخص است میتوان به سختی و استحكام پی برد.

3 - تركیب: این میكروسكوپ میتواند عناصر سازنده شئ را مشخص نماید بنابراین میتوان به خواصی مانند نقطه ذوب اكتیویته شئ نیز دست یافت.

4 - بلور شنا سی: میكرو سكوپ الكترونی چگونگی چیده شدن اتمها را در مجاورت یكدیگر را می دهد وبه این تر تیب میتوان انها را از نظر رسانایی و خواص الكتریكی بررسی نمود.

منبع : khayam.persianblog.com